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[基因芯片]基因芯片技术知识概要

来源:中国论文联盟  作者:中国论文联盟 [字体: ]
生物科学正迅速地演变为一门信息科学。最明显的一个例子就是目前正在进行的HGP(human genome project),最终要搞清人类全部基因组的30亿左右碱基对的序列。除了人的遗传信息以外,还有其它生物尤其是模式生物(model organism)已经或正在被大规模测序,如大肠杆菌、啤酒酵母、秀丽隐杆线虫以及中国和日本科学家攻关的水稻基因组计划。但单纯知晓生物基因组序列一级结构还远远不够,还必须了解其中基因是怎样组织起来的,每个基因的功能是什么,又是怎样随发育调控和微环境因素的影响而在特定的时空域中展开其表达谱的,即我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代。随着这个功能基因组学问题的提出(后基因组时代,蛋白组学)[1],涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具,最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳(2-D-gel)(及相应的质谱法测蛋白分子量)和生物芯片(Biochip)技术[2]。

  一.什么是基因芯片

  生物芯片,简单地说就是在一块指甲大小(1cm3)的有多聚赖氨酸包被的硅片上或其它固相支持物(如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等,但需经特殊处理。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基(视所要固定的分子为核酸或寡肽而定)并与保护基建立共价连接;作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子,通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等)将生物分子探针(寡核苷酸片段或基因片段)以大规模阵列的形式排布,形成可与目的分子(如基因)相互作用,交行反应的固相表面,在激光的顺序激发下标记荧光根据实际反应情况分别呈现不同的荧光发射谱征,CCD相机或激光共聚焦显微镜根据其波长及波幅特征收集信号,作出比较和检测,从而迅速得出所要的信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片。而基因芯片中,最成功的是DNA芯片,即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成点阵,与样品中同源核酸分子杂交[3]的芯片。

  基因芯片的基本原理同芯片技术中杂交测序(sequencing by hybridization, SBH)。即任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸,又称亚序列(subsequence)。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列:
  (1)     CTCATATG
  (2)     GCTCATAT
  (3)    AGCTCATA
  (4)    TAGCTCAT
  (5)   TTAGCTCA

  这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。假如只考虑完全互补的杂交,那么48个8 nt亚序列探针中,仅有上述5个能同靶DNA杂交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交,通过对杂交荧光信号检测,检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸,从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列,最后由计算机对大量荧光信号的谱型(pattern)数据进行分析,重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。

一般基因芯片按其材质和功能,基本可分为以下几类[4]

(一)元件型微阵列芯片

1.生物电子芯片

2.凝胶元件微阵列芯片

3.药物控释芯片

(二) 通道型微阵列芯片

1.毛细管电泳芯片

2 .PCR扩增芯片

3.集成DNA分析芯片

4.毛细管电层析芯片

(三)生物传感芯片

1光学纤维阵列芯片

2白光干涉谱传感芯片

小鼠基因表达谱芯片(MGEC)
 附:目前国内基因芯片常见品种.(上海博星公司) 







  三 基因芯片的制备

  芯片种类较多,制备方法也不尽相同,常见的芯片可分为两大类:一类是原位合成;一种是直接点样。原位合成适用于寡核苷酸;直接点样多用于大片段DNA,有时也用于寡核苷酸,甚至mRNA。原位合成有两种途径。一是光蚀刻法;一是喷印法。光蚀刻法可以合成30nt左右,喷印法可以合成40-50nt,光蚀刻法每步缩合率较低,一般为95%左右,合成30nt产率仅20%;喷印法可达99%以上,合成30nt产率可达74%,从这个意义上说喷印法特异性应比光刻法高。此外,喷印法不需特殊的合成试剂。与原位合成法比较点样法较简单,只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可。

  1、原位光蚀刻合成[5-7] 寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由Affymetrix公司开发的,采用的技术原理是在合成碱基单体的5'羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护,然后一个5'端保护的核苷酸单体连接上去,这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列,在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸,通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如:一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤,8个小时可能合成65,536个探针。

  目前美国Affymetrix公司已有同时检测6,500个已知人类基因的DNA芯片,并且正在制备含500,000-1,000,000个寡核苷酸探针的人类基因检测芯片。该公司每月投入基因芯片研究的经费约100万美元,目前产品尚未公开投放市场发挥经济效益,但已有许多公司及研究机构与其签约购买其产品。该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊断等,而且在大规模药物开发方面也具有诱人的前景。Affymetrix的大部分产品将在98年底全面投放市场。届时,在其产品被广泛采用的同时,其所有的研究投入将变成巨大的利润。其它公司产品也正在从实验室技术研究走向开发应用。目前,用于分子诊断的DNA芯片不仅已可用于检测爱滋病病毒基因还可用于囊性纤维化(CF)、乳腺癌、卵巢癌等疾病相关基因的基因诊断。鉴于光刻设备技术复杂,只能有专业化公司生产,加之成本高及合成效率不高的问题,因此有待进行以下研究:⑴对光刻技术进行改进,提高合成效率;⑵开发新的原位合成技术,如喷印合成技术,该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。

  另一方法是光导原位合成法。具体方法是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子(linker),其羟基上加有光敏保护基团,可用光照除去,用特制的光刻掩膜(photolithographic mask)保护不需要合成的部位,而暴露合成部位,在光作用下去除羟基上的保护基团,游离羟基,利用化学反应加上第一个核苷酸,所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定,所引入的核苷酸带有光敏保护基团,以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成,因而N个核苷酸长的芯片需要4N个步骤。每一个独特序列的探针称为一个“feature”,这样的芯片便具有4N个“feature”,包含了全部长度为N的核苷酸序列。这种原位直接合成的方法无须制备处理克隆和PCR产物,但是每轮反应所需设计的光栅则是主要的经费消耗。运用这种方法制作的芯片密度可高达106探针/平方厘米,即探针间隔为 5-10μm,但只能制作II型 DNA芯片。见图一。



  2 原位喷印合成 芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似,不过芯片喷印头和墨盒有多个,墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致,因此不特殊制备的化学试剂。

  3 点样法 点样法是将合成好的探针、cNDA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上,经一定的化学方法处理非干燥后,寡核苷酸分子即固定于载玻片上,制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。由于方法费时费力,不适于大规模DNA芯片制作,因而实现自动化点样就显得尤为重要。有的研究者用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片,经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子,点样量很小,约为5nl。大规模CDNA芯片多采用这种方法,与其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潜在优越性是具有更强的亲和势和特异性杂交,但是需要大量制备,纯化,量化,分类PCR产物。有的研究者将玻片上覆盖20μm厚薄层聚丙烯酰胺凝胶作为支持物,采用机械刻写或光刻的方法在其表面划上网格,并用激光照射蒸发掉单元间隙的多余凝胶,以实现DNA芯片分区,单元大小为 40×40μm或 100×100μm间隔分别为50μm和100μm。然后将化学方法合成的寡核苷酸探针自动化点样于各个单元内而制成DNA芯片,点样速度可达2000单元/秒。

  其装置采用的机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印针的打印/喷印头;一个减震底座,上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置、针洗涤装置。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。直接打印时针头与芯片接触,而在喷印时针头与芯片保持一定距离。打印法的优点是探针密度高,通常1平方厘米可打印2,500个探针。缺点是定量准确性及重现性不好,打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确,重现性好,使用寿命长。缺点是喷印的斑点大,因此探针密度低,通常1平方厘米只有400点。国外有多家实验室和公司研究开发打印/喷印设备,目前有一些已经商品化。军事医学科学院和益生堂生物企业公司目前正在联手利用打印/喷印技术进行生物芯片的研究和开发,预计2年内将有用于实验室研究或临床诊断的基因芯片产品问世。见图二。



  4 电子芯片[8-10] 电子芯片是由美国Nanogen公司开发的,目前国内清华大学和复旦大学也在开发这一技术。这种芯片为带有阳电荷的硅芯片、芯片经热氧化,制成1mm×1mm的阵列、每个阵列含多个微电极,在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制备出样品池。将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上,在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。电子芯片最大特点是杂交速度快,可大大缩短分析时间。制备复杂、成本高是其不足。

  5 三维芯片[11-12] 三维芯片是由美国的Packard、摩托罗拉、Argonne国家实验室三家机构与俄罗斯Engelhardt分子生物学研究所合作开发的一种芯片技术。三维生物芯片实质上是一块显微镜载玻片,其上有10,000个微小聚乙烯酰胺凝胶条,每个凝胶条可用于靶DNA,RNA和蛋白质的分析。先把乙知化合物加在凝胶条上,再用3cm长的微型玻璃毛细管将待测样品加到凝胶条上。每个毛细管能把小到0.2nl的体积打到凝胶上。以上几家机构合作研究的生物芯片系统具有其它生物芯片系统不具有的几个优点。一是凝胶的三维化能加进更多的已知物质,增加了敏感性。二是可以在芯片上同时进行扩增与检则。一般情况下,必须在微量多孔板上先进行PCR扩增,再把样品加到芯片上,因此需要进行许多额外操作。本芯片所用凝胶体积很小。使PCR扩增体系的体积减小1,000倍(总体积约纳升级),从而节约了每个反应所用的PCR酶(约减少100倍)。三是以三维构象形式存在的蛋白和基因材料可以其天然状态在凝胶条上分析,可以进行免疫测定,受体-配体研究和蛋白组分析。

  6 流过式芯片(flow-thru chip)[13] Cene Logic正在开发一种在芯片片基上制成格栅状微通道,Cene  Logic设计及合成特定的寡核苷酸探针,结合于微通道内芯片的特定区域。从待测样品中分离DNA或RNA并对其进行荧光标记,然后,该样品流过芯片,固定的寡核苷酸探针捕获与之相互补的核酸,采用Cene  Logic's信号检测系统分析结果。流通式芯片用于高通量分析已知基因的变化,其特定在于⑴敏感性高:由于寡核苷酸吸附表面的增大,流过式芯片可监测稀有基因表达的变化;⑵速度快:微通道加速了杂交反应,减少了每次检测所需时间;⑶价格降低:由于采用了特殊的共价化学技术将寡核苷酸吸附于微通道内,使每一种流过芯片可反复使用多次,从而使其成本降低。

  四.基因芯片样品制备

  一般说来应用DNA芯片进行实验包括5个过程:生物学问题的提出和芯片设计;样品制备;生物杂交反应;结果探测;数据处理和建模。 

  1.样品制备。一般所需mRNA的量是以一张表达谱芯片需要3μg mRNA计算的



  考虑到个体差异以及样品在研磨、匀浆等过程中的损失,客户提供的样品量应在上述基础上增加1-2倍。

  2 样本采集过程关键点. 

  组织标本采集操作建议规程,(取标本所需关键器材和处理要求 ) 



注:
· 以下步骤1 - 5应在冰上进行且不超过15分钟,超过时间会导致样品的RNA降解。 
· 对肿瘤组织的取材,要求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织,例如对于手术切除的整个或部分前列腺,可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。

  1 离体新鲜组织,切成多个1cm3小块,剔除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜;肝、肾、脾应剪除门部血管神经,肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净(正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净)。

  2 在RNase-Free 0.9%生理盐水中漂洗样品,以去除血渍和污物。

  3 用铝箔包裹组织,或用5ml冻存管装载组织(但最好统一采用铝箔)。用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号,并贴上标签,迅速投入液氮冷却。

  4 填写样品登记表,写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等

将液氮冷却的组织放入样品袋(每个样品袋只保存同样的组织),袋口留一根编号绳,绳上粘一张标签纸(标签上注明:样品名称、编号、日期),迅速转入便携式液氮罐

  5 保留1-2张取材部位的病理切片。

  五.生物芯片杂交

  待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同,采用的基因分离、扩增及标记方法各异。当然,常规的基因分离、扩增及标记技术完全可以采用,但操作繁琐且费时。高度集成的微型样品处理系统如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和发展方向。为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记,目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异,只是采用的荧光素种类更多,这可以满足不同来源样品的平行分析。用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号,通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。

  杂交条件的选择与研究目的有关,多态性分析或者基因测序时,每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。通常设计出一套四种寡聚核苷酸,在靶序列上跨越每个位点,只在中央位点碱基有所不同,根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度,即可测定出该碱基的种类。如果芯片仅用于检测基因表达,只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核苷酸即可。表达检测需要长的杂交时间,更高的严谨性,更高的样品浓度和低温度,这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测,要鉴别出单碱基错配,需要更高的杂交严谨性和更短的时间。

  此外,杂交反应还必须考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。有资料显示探针和芯片之间适当长度的连接臂可使杂交效率提高150倍[9]。连接臂上任何正或负电荷都将减少杂交效率。由于探针和检测基因均带负电荷,因此影响他们之间的杂交结合,为此有人提出用不带电荷的肽核酸(PNA)做探针[9]。虽然PNA的制备比较复杂,但与DNA探针比较有许多特点,如不需要盐离子,因此可防止检测基因二级结构的形成及自身复性。由于PNA-DNA结合更加稳定和特异,因此更有利于单碱基错配基因的检测。

  六 基因芯片检测原理

  杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部分。以往的研究中已形成许多种探测分子杂交的方法,如荧光显微镜、隐逝波传感器、光散射表面共振、电化传感器、化学发光、荧光各向异性等等,但并非每种方法都适用于DNA芯片。由于DNA芯片本身的结构及性质,需要确定杂交信号在芯片上的位置,尤其是大规模DNA芯片由于其面积小,密度大,点样量很少,所以杂交信号较弱,需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupled device camera,CCD)摄像机等弱光信号探测装置。此外,大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度,以确定是完全杂交还是不完全杂交,因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。

  由于所使用的标记物不同,因而相应的探测方法也各具特色。大多数研究者使用荧光标记物,也有一些研究者使用生物素标记,联合抗生物素结合物检测DNA化学发光。通过检测标记信号来确定DNA芯片杂交谱型。 

    1.荧光标记杂交信号的检测方法
    使用荧光标记物的研究者最多,因而相应的探测方法也就最多、最成熟。由于荧光显微镜可以选择性地激发和探测样品中的混合荧光标记物,并具有很好的空间分辨率和热分辨率,特别是当荧光显微镜中使用了共焦激光扫描时,分辨能力在实际应用中可接近由数值孔径和光波长决定的空间分辨率,而在传统的显微镜是很难做到的,这便为DNA芯片进一步微型化提供了重要的检测方法的基础。大多数方法都是在人射照明式荧光显微镜(epifluoescence microscope)基础上发展起来的,包括激光扫描荧光显微镜、激光共焦扫描显微镜、使用了CCD相机的改进的荧光显微镜以及将DNA芯片直接制作在光纤维束切面上并结合荧光显微镜的光纤传感器微阵列。这些方法基本上都是将待杂交对象 以荧光物质标记,如荧光素或丽丝胶(lissamine)等,杂交后经过SSC和SDS的混合溶液或SSPE等缓冲液清洗。

    (1)激光扫描荧光显微镜
    探测装置比较典型。方法是将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上,并将一物镜置于其上方,由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面,激发荧光标记物产生荧光,光斑半径约为5-10μm。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后,由冷却的光电倍增管探测,经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制传动平台X-Y方向上步进平移,DNA芯片被逐点照射,所采集荧光信号构成杂交信号谱型,送计算机分析处理,最后形成20μm象素的图像。这种方法分辨率高、图像质量较好,适用于各种主要类型的DNA芯片及大规模DNA芯片杂交信号检测,广泛应用于基因表达、基因诊断等方面研究。

    (2)激光扫描共焦显微镜
    激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似,但是由于采用了共焦技术因而更具优越性。这种方法可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测,而无须清洗掉未杂交分子,从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。Affymetrix公司的S.P.A.Forder等人设计的DNA芯片即利用此方法。其方法是将靶 DNA分子溶液放在样品地中,芯片上合成寡核苷酸阵列的一面向下,与样品池溶液直接接触,并与DNA样品杂交。当用激发光照射使荧光标记物产生荧光时,既有芯片上杂交的DNA样品所发出的荧光,也有样品地中DNA所发出的荧光,如何将两者分离开来是一个非常重要的问题。而共焦显微镜具有非常好的纵向分辨率,可以在接受芯片表面荧光信号的同时,避开样品池中荧光信号的影响。一般采用氩离子激光器(488nm)作为激发光源,经物镜聚焦,从芯片背面入射,聚集于芯片与靶分子溶液接触面。杂交分子所发的荧光再经同一物镜收集,并经滤波片滤波,被冷却的光电倍增管在光子计数的模式下接收。经模数转换反转换为数字信号送微机处理,成像分析。在光电信增管前放置一共焦小孔,用于阻挡大部分激发光焦平面以外的来自样品池的未杂交分子荧光信号,避免其对探测结果的影响。激光器前也放置一个小孔光阑以尽量缩小聚焦点处光斑半径,使之能够只照射在单个探针上。通过计算机控制激光束或样品池的移动,便可实现对芯片的二维扫描,移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配,在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。其特点是灵敏度和分辨率较高,扫描时间长,比较适合研究用。现在 Affymetrix公司已推出商业化样机,整套系统约 12万美元。

    (3)采用了CCD相机的荧光显微镜
    这种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微镜,但是以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍增管,因而无须扫描传动平台。由于不是逐点激发探测,因而激发光照射光场为整个芯片区域,由CCD相机获得整个DNA芯片的杂交谱型。这种方法一般不采用激光器作为激发光源,由于激光束光强的高斯分布,会使得光场光强度分布不均,而荧光信号的强度与激发光的强度密切相关,因而不利于信号采集的线性响应。为保证激发光匀场照射,有的学者使用高压汞灯经滤波片滤波,通过传统的光学物镜将激发光投射到芯片上,照明面积可通过更换物镜来调整;也有的研究者使用大功率弧形探照灯作为光源,使用光纤维束与透镜结合传输激发光,并与芯片表面呈50o角入射。由于采用了CCD相机,因而大大提高了获取荧光图像的速度,曝光时间可缩短至零点几秒至十几秒。其特点是扫描时间短,灵敏度和分辨率较低,比较适合临床诊断用[14].

    (4)光纤传感器
    有的研究者将 DNA芯片直接做在光纤维束的切面上(远端),光纤维束的另一端(近端)经特制的耦合装置耦合到荧光显微镜中。光纤维束由7根单模光纤组成。每根光纤的直径为200μm,两端均经化学方法抛光清洁。化学方法合成的寡核苷酸探针共价结合于每根光纤的远端组成寡核苷酸阵列。将光纤远端浸入到荧光标记的靶分子溶液中与靶分子杂交,通过光纤维束传导来自荧光显微镜的激光(490urn),激发荧光标记物产生荧光,仍用光纤维束传导荧光信号返回到荧光显微镜,由CCD相机接收。每根光纤单独作用互不干扰,而溶液中的荧光信号基本不会传播到光纤中,杂交到光纤远端的靶分子可在90%的甲酸胺( formamide)和TE缓冲液中浸泡10秒钟去除,进而反复使用。这种方法快速、便捷,可实时检测DNA微阵列杂交情况而且具有较高的灵敏度,但由于光纤维束所含光纤数目有限,因而不便于制备大规模DNA芯片,有一定的应用局限性。

  2.生物素标记方法中的杂交信号探测
     以生物素(biotin)标记样品的方法由来已久,通常都要联合使用其它大分子与抗生物素的结合物(如结合化学发光底物酶、荧光素等),再利用所结合大分子的特殊性质得到最初的杂交信号,由于所选用的与抗生物素结合的分子种类繁多,因而检测方法也更趋多样化。特别是如果采用尼龙膜作为固相支持物,直接以荧光标记的探针用于DNA芯片杂交将受到很大的限制,因为在尼龙膜上荧光标记信号信噪比较低。因而使用尼龙膜作为固相支持物的这些研究者大多是采用生物素标记的。

  目前应用较多的是美国General Scanning公司开发的基因芯片专用检测系统(ScanArray 3000),采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集,由计算机处理荧光信号,并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。近期又开发出了ScanArray 5000,其扫描精度和功能有较大的提高。

七 结果的分析

  样品在被测定前,首先要经过消化,使待测组织细胞中的DNA或RNA释放出来,在经过适当的扩增后,以荧光标记物标记,放入基因芯片自动孵育装置(Fluidics Station)中,由其自动控制反应的时间、温度以及缓冲液的配比等反应条件,进行杂交,这一过程,仅需要数秒钟。杂交完成后,要对基因芯片进行“读片”,即应用激光共聚焦荧光扫描显微镜,对基因芯片表面的每个位点进行检测。这种显微镜,将聚焦的平面设定为芯片的表面,因此可以检测结合到芯片表面位点的样品片断的荧光标记,而待测样品中未与芯片上探针结合的荧光标记物,则悬浮于溶液中,由于不在聚焦平面上,因而不被检测。样品与探针的错配是影响杂交反应结果的重要因素,但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错配时强的多,因此,通过对信号强度的分析,就可以区分正确与错误的配对。

  为了使结果的检验更加简便和快速,Affymetrix的基因芯片的分析系统中采用了基因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站,对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的分析,仅需要数分钟的时间。这样在短短的几十分钟至数小时内,就可以完成用传统方法需要数月才能完成的几万乃至几十万次杂交分析试验。

  八 基因芯片的应用

  (一)基因表达分析 基因芯片具有高度的敏感性和特异性,它可以监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情况。与用单探针分析mRNA的点杂交技术不同,基因芯片表达探针阵列应用了大约20对寡核苷酸探针来监测每一个mRNA的转录情况。每对探针中,包含一个与所要监测的mRNA完全吻合和一个不完全吻合的探针(图2),这两个探针的差别在于其中间位置的核苷酸不同。这种成对的探针可以将非特异性杂交和背景讯号减小到最低的水平,由此我们就可以确定那些低强度的mRNA。目前,Affymetrix公司已经生产出HugeneFL、Mu6500(含有小鼠6 500个基因)、Ye6100(含有酵母6 100个基因)等基因芯片成品。

  1 分析基因表达时空特征。英国剑桥大学Whitehead研究所的Frank C.P. Holstege等人,应用含有酵母基因组的基因芯片,深入研究了真核细胞基因组的调节周期。应用基因组水平的表达分析,监测那些表达受转录起始机制的关键成分控制的基因,发现RNA聚合酶II、主要的转录因子TFIID和SAGA染色体修饰复合物等均在基因的表达中有自己特定的作用位点[15]。通过本试验,研究人员揭示了:(1)基因特异性的转录因子对表达的调控作用。(2)细胞在缺乏营养的环境中,基因不同位点的协同调节作用的全新机制。(3)信号转导通路的最终作用位点,在最初的几步中就可以确定。以此试验为基础,研究人员进一步绘制出了酵母基因组控制图,并由此分析出了各种调节因子在基因上不同的作用位点和其作用的分子机制。

  美国Stanford大学的V.R.Iyer等人[16],对成纤维细胞中与细胞增生和损伤修复有关的基因进行了分析。首先,他们用成纤维细胞中的8 600个基因片断制成基因芯片的探针阵列,通过与mRNA反转录形成的cDNA的杂交反应,可以判断出该基因的活性。在试验中,成纤维细胞被置于无营养的环境中,使绝大部分基因的活性关闭,两天后,加入10%的血清,24小时内,分6个不同的时间点,观察基因的活化情况。试验结果表明,在所有被监测的基因中,约有500个基因最为活跃,而使细胞保持不分裂状态的基因活性被抑制。其中,最早被活化的是那些转录调控基因。在活化的基因中,有28个基因共同作用,控制细胞的增殖;8个与免疫反应的激活有关;19个与血管重建有关;另有许多基因,与血管新生密切相关。在肿瘤细胞中,基因的表达与正常的细胞存在着明显的差异。通过基因芯片绘出基因表达的时空图谱,有助于人类认识生命活动过程和特征。

  2 基因差异表达检测〔17〕 生命活动中基因表达的改变是生物学研究的核心问题。理解人类基因组中10万个不同的基因功能,监测某些组织、细胞不同分化阶段的差异基因表达(differential gene expression ,DGE)十分重要。对差异表达的研究,可以推断基因与基因的相互关系,细胞分化中基因“开启”或“关闭”的机制;揭示基因与疾病的发生、发展、转归的内在联系。目前DGE研究方法主要有表达序列标签(ESTs)测序、差减克隆(subtractive cloning )、差异显示(differential display)、基因表达系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)。而cDNA微阵列杂交技术可监测大量mRNA的转录,直接快速地检测出极其微量的mRNA,且易于同时监测成千上万的基因,是研究基因功能的重要手段之一。Rihn BH等利用基因芯片检测胸膜间皮瘤与正常细胞间比较了6500个基因,,发现了300多个差异基因的表达。其中几个典型基因的表达经RT-PCR进行定量后,可作为胸膜间皮瘤诊断的标记物(Markers)[18]。Sgroi〔19〕报告DNA芯片结合激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection)用于乳癌浸润期和转移期及正常细胞的基因表达谱(gene expression profiles)差异研究,结果被定量PCR和免疫组化所证实。差异表达有助于早期发现瘤细胞3万个基因与正常细胞的区别,有助于了解瘤细胞的发生、浸润、转移和药敏。最近,美国毒物化学研究所(CIIT) 和国家环境健康科学研究所(NIEHS)正计划在一张玻片上建立8 700个小白鼠cDNA芯片,用于肝癌的研究。我国也已成功研制出能检出41 000种基因表达谱的芯片。美国Stanford大学的David BotstEin利用cDNA微阵列芯片,对乳腺癌细胞的基因表达进行了分析,发现其基因表达水平明显低于正常细胞。利用基因芯片对表达进行分析,在一次试验中可以获取相当于在60余万次传统的Northern杂交中所获得的关于基因表达的信息。通过这种实验方法,可以建立一种全新的肿瘤分类学方法,即依据每个肿瘤细胞中的基因表达情况对肿瘤细胞进行分类。基因芯片技术在分析基因的表达中具有不可比拟的优势。

    3 发现新基因 Moch等利用肿瘤微阵列芯片(5 184个cDNA片段)发现了肾细胞癌的肿瘤标志物基因,并于正常细胞进行比较。在532份标本中检测到胞浆纤维Vimentin的表达基因,阳性率为51%~61%〔20〕。追踪观察,有Vimentin表达的患者,预后极差。人类大量ESTs给cDNA微阵列提供了丰富的资源,数据库中400 000个ESTs代表了所有人类基因,成千上万的ESTs微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。这将大大地加速人类基因组的功能分析〔21〕。

  定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶等方面是很有价值的。如该技术在炎症性疾病类风湿性关节炎(RA)和炎症性肠病(IBD)的基因表达研究中,由RA或IBD组织制备探针,用Cy3和Cy5荧光素标记,然后与靶cDNA微阵列杂交,可检测出炎症疾病诱导的基因如TNF-α、IL或粒细胞集落刺激因子,同时发现一些以前未发现的基因如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子。Schena等人[22]报道了cDNA的微阵列在人类基因表达监测、生物学功能研究和基因发现方面的应用。采用含1,046个已知序列的cDNA微阵列,用高速机器人喷印在玻片上,用双色杂交法定量监测不同基因表达,在一定的实验条件下,不同表达模式的阵列成分通过序列分析鉴定其特征。该方法较以往常用的方法敏感10倍以上,检测限度为1:500,000(wt/wt)总人体mRNA。在培养T细胞热休克反应的测定中,发现17个阵列成分的荧光比较明显改变,其中11个受热休克处理的诱导,6个呈现中度抑制,对相应于17个阵列成分的cDNA测序发现5个表达最高的成分是5种热休克蛋白,17个克隆中发现3个新序列。另外,在佛波酯诱导检测中[23],发现有6个阵列成分信号增强超过2倍,测序及数据库比较揭示有5个已知的,诱导表达最高的两个是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-κB1,有一个是未知的。这4个新基因的表达水平均相对较低,仅呈现2倍的诱导。Northern杂交结果证实了微阵列的结果。进一步检测了人的骨髓、脑、前列腺及心脏组织中热休克和佛波酯调节基因的表达,4种组织中检测出15种热休克和佛波酯调节基因的表达,其表达水平与Jurkat细胞中相应成分的表达水平密切相关如在四种组织中表达水平最高的两个基因β-actin和细胞色素C氧化酶在Jurkat细胞中的表达水平也很高。上述实验提示在缺乏任何序列信息的条件下,微阵列可用于基因发现和基因表达检测。目前,大量人类ESTs给cDNA微阵列提供了丰富的资源,数据库中400,000个ESTs代表了所有人类基因,成千上万的ESTs微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。这将大大地加速人类基因组的功能分析。

    4 大规模DNA测序 人类基因组计划的实施促进了高效的、自动化操作的测序方法的发展。芯片技术中杂交测序(sequencing by hybridization, SBH)技术及邻堆杂交(contiguous stacking hybridization, CSH)技术即是一种新的高效快速测序方法[24-26]。用含65 536个8聚寡核苷酸的微阵列,采用SBH技术,可测定200 bp长DNA序列,采用67 108 864个13聚寡核苷酸的微阵列,可对数千个碱基长的DNA测序。SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高,但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性,降低了杂交准确性。CSH技术弥补了SBH技术存在的弊端,CSH技术的应用增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度,加强了序列准确性,可进行较长的DNA测序。计算机模拟论证了8聚寡核苷酸微阵列与5聚寡核苷酸邻堆杂交,相当于13聚寡核苷酸微阵列的作用,可测定数千个核苷酸长的DNA序列[26]。Dubiley等人[26]将合成的10聚寡核苷酸固定于排列在载片表面的0.1×0.1×0.02mm或1×1×0.02mm聚丙酰胺凝胶垫上制备聚寡核苷酸微阵列,先用分离微阵列(fractionation chips)进行单链DNA分离,再用测序微阵列(sequencing chips)分析序列,后者联合采用了10聚寡核苷酸微阵列的酶促磷酸化、DNA杂交及与邻堆的5聚寡核苷酸连接等技术。该方法可用于含重复序列及较长序列的DNA序列测定及不同基因组同源区域的序列比较。利用基因芯片测序的准确率达99%以上。

  正如NIH首脑Harold Varmus在美国细胞生物学1998年年会上所说:“在基因芯片的帮助下,我们将能够监测一个细胞乃至整个组织中所有基因的行为。”

  (二)基因型、基因突变和多态性分析 

  在同一物种不同种群和个体之间,有着多种不同的基因型,而这种不同,往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较,就可以得出基因与性状的关系。但是,由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时决定的,因此分析起来就十分困难,然而基因芯片技术恰恰解决了这一问题,利用其可以同时反应数千甚至更多个基因的特性,我们就可以分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。美国Stanford大学的E.A.Winzeler等[27],以两种不同菌株的酵母(S96和YJM789)作为实验材料,对控制酵母对放线菌酮的抗药性的基因进行分析。将含有酵母150 000个DNA片断的基因芯片分别与这两株酵母活化转录的mRNA分子杂交,S96几乎全部吻合,而YJM789与芯片上的探针组存在较大的差异,约有3000个位点没有杂交显色。由于S96对放线菌酮有抗药性而YJM789的抗药性则弱的多,因此可以判定控制这一抗药性的基因的所在。而后,通过对S96和YJM789杂交后产生的抗药子代的遗传标记的分析,进一步确定,控制该抗药性的基因位于15号染色体,是一长约57 000个碱基的片断。美国国家人类基因组研究室的J.G.Hacia等在Fodor研究小组的协助下[28],将基因芯片应用于双色突变分析。他们的分析对象是与人类遗传性乳腺癌和卵巢癌密切相关的BRCA1基因的外显子11。在扩增后,将BRCA1基因的外显子11置于含有荧光素-12-UTP的环境中进行体外转录反应,而后将转录产生的mRNA与BRCA1外显子11芯片杂交,4小时后,用藻红蛋白染色。在观察时,用488nm的氩离子激光进行扫描,荧光染色位点呈现绿色,而藻红蛋白染色的位点呈现红色。应用双色分析,可以更为清楚的监测未知样品与标准链之间的竞争性杂交情况,进而分析该基因中的不同突变。通过对15名患者BRCA1基因的观察,有14名患者在外显子11位点存在不同的突变。Hacia等[29]在1.28 cm×1.28 cm的芯片上固定了9.66×104个长度为20 nt的寡核苷酸探针,用于检测乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的碱基置换、插入和缺失(1~5 bp)突变。针对每一个位点,共有28个独立的探针,14个针对有义链,14个针对反义链。14个探针包括2个野生型,3个碱基置换、4个插入突变、5个碱基缺失。在15例患者样品中,发现有14例有基因突变,类型包括点突变、插入及缺失等;在20例对照样品中均未检出假阳性结果,结果表明DNA芯片技术可快速、准确地研究大量患者样品中特定基因所有可能的杂合变。Cronin等[30]分别用两种DNA芯片检测囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)的突变,其中一个芯片包含1 480个探针,检测了CFTR基因的第10和11外显子的已知突变,包括缺失、插入和单碱基置换,并分析了10个未知样品的CFTR基因,其结果与PCR-RELP的分析结果完全一致。

  Guo等人[31]利用结合在玻璃支持物上的等位基因特异性寡核苷酸(ASOs)微阵列建立了简单快速的基因多态性分析方法。将ASOs共价固定于玻璃载片上,采用PCR扩增基因组DNA,其一条引物用荧光素标记,另一条引物用生物素标记,分离两条互补的DNA链,将荧光素标记DNA链与微阵列杂交,通过荧光扫描检测杂交模式,即可测定PCR产物存在的多种多态性,该方法对人的酪氨酸酶基因等4个外显子内含有的5个单碱基突变进行分析,结果显示单碱基错配与完全匹配的杂交模式非常易于区别。这种方法可快速、定量地获得基因信息。β-地中海贫血中变异的检测也论证了该方法的有效性和可信性[32]。Lipshutz等人[33]采用含18,495个寡核苷酸探针的微阵列,对HIV-1基因组反转录酶基因(rt)及蛋白酶基因(pro)的高度多态性进行了筛选。微阵列中内部探针与靶序列的错配具有明显的不稳定性,据此可快速区别核酸靶的差异。例如检测序列5'GTATCAGCATXGCCATCGTGC中X碱基的种类,可用下列4种探针3'AGTCGTAACGGTAGC,3'AGTCGTACCGGTAGC,3'AGTCGTAGCGGTAGC,3'AGTCGTATCGGTAGC。高密度探针阵列可检则具有特征性的较长序列相关的多态性与变异。筛选1,000个核苷酸序列的变异与多态性需要4,000个探针。用100μm合成位点,设计1.28cm2阵列,将有大约16,000个探针,能筛选4kb序列。HIV-1基因组中rt与pro在疾病过程中易于发生多种变异,这些变异将导致病毒对多种抗病毒药物包括AZT、ddI、ddC等出现明显抗性,因此检测和分析rt与pro的变异与多态性具有重要的临床意义。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加,变异与多态性分析将越来越重要。Chee等[34]用含有1.35×105个长度为25 nt的寡核苷酸探针,分析了16.6 kb的人类线粒体基因组DNA(mt DNA),共分析了10个样本,检测出了505个多态性位点,并在Leber′s遗传性视神经疾病患者的mt DNA中检测出3个致病性突变位点。

  随着人类基因组计划的逐步发展,研究人员分析出了越来越多的基因序列。下一步,就是要分析这些基因的多态性与生物功能和疾病的关系,而这需要对大量个体进行分析。通过基因芯片SNP(单核苷酸多态性)定位试验,可以确定基因多态性和疾病的关系,同时也可确定致病的机制和病人对治疗的反应等。同样,对于许多与人类疾病密切相关的致病微生物,也可对其进行基因型和多态性分析,1998年,法国T.Livache等[35]就成功的利用基因芯片技术,对人血中的HCV病毒进行了基因型分析。SNP基因芯片的成功将使临床诊断上到一个新的台阶。

  (三)疾病的诊断与治疗 人类的疾病与遗传基因密切相关,基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析,因此它在疾病的分子诊断中的优势是不言而喻的,就临床一种新的、强有力的分子工具[36]。基因芯片技术已经被应用于感染性疾病、肿瘤和药物代谢等方面的研究。

  1 遗传病相关基因的定位 90年代以来,随着人类基因组计划的发展,各种方法被相继创立并应用到基因定位中。我国有4 000万育龄妇女,每年有2 000万新生儿,准确检测遗传病基因是优生优育的技术保障。DNA芯片充分结合并灵活运用了大规模集成电路制造技术、自动化技术、计算机及网络技术、激光共聚焦扫描、DNA合成、荧光标记探针、分子杂交及分子生物学的其它技术,在这一领域的研究中有着巨大的潜力。这一技术已成为基因定位研究的高效工具。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加,变异与多态性分析将越来越重要。HGP使许多遗传疾病基因得以定位,配合使用多位PCR (multiplex-PCR) /DNA芯片可一次筛查多种遗传病,既经济快速又敏感可靠[37,38]。

    2 肿瘤诊断 已用基因芯片检测人鼻咽癌、肺癌基因表达谱、肿瘤原癌基因和抑癌基因的发现和定位。早在1996年,M.J.Kozal等就利用基因芯片[39],对HIV-I B亚型中的蛋白酶基因的多态性进行了分析,这也是基因芯片技术被首次应用于临床实践。在艾滋病的治疗中,使用HIV蛋白酶抑制剂是一种重要的手段。然而,病毒对该药物的反应却有着很大的差异。利用基因芯片技术,研究人员分析了取自102个病人的167个病毒单体,发现这些同为美国HIV-I B亚种的病毒的基因序列存在极大差异,其中蛋白酶的基因片断差异最大,在编码99个氨基酸的序列中,竟有47.5%存在明显突变。这些氨基酸的突变,直接导致了病毒抗药性的不同。含96 600个20体寡核苷酸高密度阵列对遗传性乳腺和卵巢癌BRCA1基因3.45 kb的第11个外显子进行杂合变异筛选,15个患者的已知变异的样品中,准确诊断出14个患者,20个对照样品中未发现假阳性。用Affimetrix p53芯片和PCR-SSCP调查42例有乳癌史的家系,p53基因13 964位的G变为C,突变率为7.1%;无乳癌家族史者为0。Favis等用多位PCR/连接酶检测反应(PCR/LDR)在一个试管内同时检测数百个基因突变,用于检测大肠癌组织k-ras 和p53突变及BRCA-1和BRCA-2低频率突变收到良好效果。

    人类恶性肿瘤中,约有60%与人类p53抑癌基因的突变有关,目前研究人员已经研制成功了可以检测p53基因所有编码区(外显子2~外显子11)错意突变和单碱基缺失突变的基因芯片。以外显子7的第248个密码子为例,野生型为CGG,在芯片上做出5条探针,相应位点分别为GAC、GCC、GGC、GTC和G-C,根据杂交后的荧光显色图,就可以分析出该位点为何种突变。

  3 感染性疾病的诊断 HIV-1基因组中rt与pro在疾病过程中易于发生多种变异,这些变异将导致病毒对多种抗病毒药物包括AZT、ddI、ddC等出现明显抗性,因此检测和分析rt与pro的变异与多态性具有重要的临床意义。Hayward[40]以3 648个插入片段建立猎枪微阵列(shotgun microarray),通过差异杂交和DNA测序找到了疟原虫无性和有性生殖阶段基因差异表达,为抗疟药设计提供了线索。可以预测在不久的将来,人们可望在一张DNA芯片上检测几乎所有的病原微生物基因,实现真正意义上的“组合检测(profile tests)”。

    4 耐药菌株和药敏检测 据WHO报告,全球每年约有800万结核病患者,有300万人死亡,死亡人数超过了艾滋病和疟疾的总和。主要原因是菌株对不同的药物产生了抗药性(俄国80%TB对一种药物产生抗性;美国50%为多重耐药)。对每例患者进行菌株和药敏鉴定是控制TB的关键。最近,俄美两国科学家开发了具此功能的基因芯片,可使医生及早使用敏感药物。该芯片(TB Biochips)将抗性菌株的单链DNA标记后固定在玻片上,与待检TB株杂交,临床使用未见假阳性,该芯片可清洗后重复使用50次。

    (四)药物研究中的应用

  从经济效益来说,最大的应用领域可能是制药厂用来开发新药。所以已经有多家制药企业介入芯片的开发。如: Incyte Pharmaaceuticals Inc.,Sequana Therapeutics,Millenium Pharmaceuticals Inc.等。对于寻找新药来说,目标之一是应用芯片可以在基因水平上寻找药物靶标。采用所谓“译码器”策略(Decoder strategy)来确定药物靶标。从而找到“导向药物”。基因芯片也被用于寻找蛋白激酶抑制物。细菌或肿瘤组织的耐药性也涉及基因改变可以用DNA芯片鉴定。

    1 新药开发 高通量的DNA芯片可发现众多的新基因和新的靶分子用于新药的设计。噬菌体展示技术可创造大量蛋白质,目前多用于抗体库的建立和筛选,进而可用于受体-配体相互作用的研究。基因组学、蛋白质组学和生物信息学(bioinformatics)将大大促进制药工业的发展。目前第一个生物分子工程药物Herceptin已用于乳癌的治疗,并获得美国FDA的批准。除肿瘤外,用分子生物工程设计的药物可用于治疗遗传病及代谢疾病、抗衰老、设计新的抗生素和工业用酶等。

  同时,有时一种药物的作用是多方面的,基因芯片有助于发现一种药物的新的功能。原先设想的作用是针对某一靶标的,但在全基因或广范围筛选中却发现该药在另一方面有很强的抑制作用,从而开发成另一种新药。

  2 调查药物处理细胞后基因的表达情况
  基因芯片在用来研究药物的作用机理时十分有用。Marton[40]等人利用基因芯片构建了免疫抑制性药物FK506处理酵母细胞后的基因表达图谱。发现用FK506处理的酵母细胞基因表达图谱与FK506靶标的无意义突变体相似。而用FK506去处理此突变体,发现了不同于野生型的作用机制。Clarke等[41]用基因芯片研究了肠癌患者化疗前和治疗期间肿瘤基因表达情况,发现丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶治疗均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表达增加。该研究提示,这类研究既有助于阐明药物的作用机制,也有助于确定药物作用的靶基因,为新药研究提供线索。

   3 对药物进行毒性评价
  应用芯片查找药物的毒性或副作用,进行毒理学研究。尤其是慢性毒性和副作用,往往涉及基因或基因表达的改变。如果药物能抑制重要基因的表达,则对它的深入研究就值得考虑。用芯片作大规模的表达研究往往可省略大量的动物试验。若某个正在筛选的潜在药物作用靶细胞得到的基因表达图谱与已知的具有毒性副作用的药物得到的基因表达图谱相似时,就要考虑是否停止药物开发(drug development)中花费巨大的临床实验阶段。Nuwaysir等[42]研制了包括涉及细胞凋亡、DNA复制和修复、氧化应激/氧化还原内稳态、过氧化物酶体增殖反应、二英/多环芳烃反应、雌激素反应、看家基因、癌基因和抑癌基因、细胞周期控制、转录因子、激酶、磷酸酶、热休克蛋白、受体、细胞色素P450等共2 090个基因的毒理芯片(ToxChip v1.0), 该芯片既可用于毒物的检测和遗传多态性的检测,又可用于受检毒物的毒作用机制的研究。最近,Holden等从人和小鼠文库中选择约600个与毒理学相关基因的cDNA克隆,制备了种属特异的毒理基因组学芯片,可研究肝脏毒性、内分泌干扰、致癌作用等毒性终点的作用机制,也可用于确定以基因表达模式为基础的化合物的毒性。

  (五)基因芯片中医学领域中的应用

  中医学中应用基因芯片技术,还处于初始阶段,目前主要集中以下三个方面:

  1 中药的研究,具体的方法,同上述药物筛选方法类似。尤其中药中众多成分中有效成分的筛选、有效药物的筛选、中药毒理学过程均被大大简化,将推动中药的迅猛发展。中药学引入基因芯片技术,将大大推动中药研究的国际化进程,为阐明中药作用机理,具有无可估量的重要意义。

  2 中医“证”本质的研究。中医“证”的中医药的临床治疗的核心,但“证”的本质研究一直难以有重大进展。主要因为中医理论设及到生命的整体,因而它牵涉到许多基因和蛋白质,传统的方法学无法弄清“证”的实质,而利用基因芯片技术,对不同“证”状态的基因组进行扫描,再绘出不同证的基因表达谱,通过相关分析,可望获得一些有意义的成果。也是从分子基因水平全面揭示“证”本质提供了可能。如果证本质被揭示,它可能会引起医学治疗学理论的重大革新或变化,尤其是个体化治疗方案可能重新被重视。

  3 针灸原理研究。针灸的原理设及全身各个部分,针灸不同方法、不同穴位、经络是否具有不同的作用,也即经脉与脏腑间的相关联系是否具有相对特异性。通过基因芯片测量不同组织基因表达的差异,判断基因表达是否具有特异性,有望解决这一长期争论不休的问题。如果心经与心脏具有相对特异性,那么针刺心经后,心脏内可能会出现某些与针刺相关的特异性基因表达,而且,这种表达只在针刺心经时出现,这些基因可能不在其它器官,如肝脏中表达。那么可以肯定地认为经脉脏腑相关是具有相对特异性的,也可以认为传统经络理论是有依据的。

  另一方面,基因芯片还有助于揭示针灸的作用机制。针灸的作用是与神经内分泌免疫网络系统(NEI networks)密切相关的,它设及到细胞信使、神经递质、调质、神经肽、细胞因子、内分泌激素等多种因子,但针灸的信号是如何在细胞间和细胞内传递的过程仍不明朗,如果引入基因芯片,可以高通量的检测细胞内基因表达的时空特征,有助于了解针灸促进基因表达的特点,进而再利用蛋白组学相关技术,揭示针灸作用原理。现在已有部分工作正在进行。

  (六)其它应用

  1 环境化学毒物的筛选 我们的生活环境中存在着数千种化学物质,每种物质在投入使用前必须进行人体毒性试验,传统的动物试验费用高昂,且存在着国际上关注的动物福利(animal welfare)问题。采用毒物检测芯片(Toxchips)可对环境中众多化学物质对人类基因的潜在毒性进行筛选,探查毒物“开启”或“关闭”哪些基因,研究“环境如何改变我们的基因”。NIEHS将对人类100 000个基因中的12 000个基因进行检测,弄清致癌物质对基因的改变,建立化学物质指纹库(fingerprints of chemicals),然后即可通过测定特定基因的突变与否判断新的合成物质的生物毒性。

  2 体质医学的研究。体质医学关系到个体化治疗的核心问题,不同的人具有不同的体质基础,其原因与基因型可能存在一定的相关性,尤其可能与SNP关系较大,如何全面了解人的SNP差异,以及它与体质因素、疾病的易感性间关系,是值得研究的重大课题。

  美国继开展人类基因组计划以后,于1998年正式启动基因芯片计划,美国国立卫生部、能源部、商业部、司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如Argonne Oakridge也参与了该项目的研究和开发。英国剑桥大学、欧亚公司正在从事该领域的研究。世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣,都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。目前全世界有几百家基因芯片公司,有多种生物芯片问世,而且这些芯片的特点较以前密度更高,检测方法更精确,特异性更强的特点。而主要仍以少数几家公司为主,如Affymetrix、Brax、Hysep等。国内目前主要如清华大学(陈京)、中科院生命科学院、上海复旦大学、北京军事科学院、南京东南大学、西安等四十余家公司,而且可能还有一大批公司相继成立。

  主要DNA芯片高科技术企业的开发善和各自技术特点(1998年)[43]



  十、当前面临的困难

  尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展,得到人们的瞩目,但仍然存在着许多难以解决的问题,例如技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低,重复性差、分析泛围较狭窄等问题。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。

  1 样品制备上,当前多数公司在标记和测定前都要对样品进行一定程度的扩增以便提高检测的灵敏度,但仍不少人在尝试绕过该问题,这包括Mosaic Technologies公司的固相PCR扩拉体系以及Lynx Therapeutics公司提出大量并行固相克隆方法,两种方法各有优缺点,但目前尚未取得实际应用。

  2 探针的合成与固定比较复杂,特别是对于制作高密度的探针阵列。使用光导聚合技术每步产率不高(95%),难于保证好的聚合效果。应运而生的其它很多方法,如压电打压、微量喷涂等多项技术,虽然技术难度较低方法也比较灵活,但存在的问题是难以形成高密度的探针阵列,所以只能在较小规模上使用。最近我国学者已成功地将分子印章技术应用探针的原位合成而且取得了比较满意的结果。

  3 目标分子的标记也是一个重要的限速步骤,如何简化或绕过这一步现在仍然是个问题。目标分子与探针的杂交会出现一些问题:首先,由于杂交位于固相表面,所以有一定程度的空间阻碍作用,有必要设法减少这种不利因素的影响。Southern曾通过向探针中引入间隔分子而使杂交效率提高于150倍。其次,探针分子的GC含量、长度以及浓度等都会对杂交产生一定的影响,因此需要分别进行分析和研究。

  4 信号的获取与分析上,当前多数方法使用荧光法进行检测和分析,重复性较好,但灵敏仍然不高。正在发展的方法有多种,如质谱法、化学发光法等。基因芯片上成千上万的寡核苷酸探针由于序列本身有一定程度的重叠因而产生了大量的丰余信息。这一方面可以为样品的检测提供大量的难证机会,但同时,要对如此大量的信息进行解读,目前仍是一个艰巨的技术问题。

  5 基因芯片的特异性还有待提高。最近Affymetrix公司生产的基因芯片采用瓣的技术,已大大提高检测的特异性,估计在今后几年内基因芯片的特异性将大大提高。

  6 如何检测低丰度表达基因仍是目前一个重要问题。基因芯片要保证其特异性、但又要保证能检测低丰度表达的基因,目前尚未解决这一问题。因为许多低丰度表达的基因,也可能表达出主要执行效应功能的蛋白质。因为基因表达与蛋白质生成并不成比例。

  上述问题不仅是当前和今后一段时期内国内外基因芯片技术研究的焦点,同时也是基因芯片能否从实验室研究推向临床应用的关键问题。

  十一  基因芯片技术的研究可能方向

  纵观当前基因芯片的研究趋势,基因芯片在今后几年内可能的发展方向,可能有以下几个方面:

  1.进一步提高探针阵列的集成度,如有多家公司的芯片阵列的集成度已达1.0×105左右,这样基因数量在1.0×105以下的生物体(大多数生物体)的基因表达情况只用一块芯片即可包括。

  2 提高检测的灵敏度和特异性。如检测系统的优化组合和采用高灵敏度的荧光标志。多重检测以提高特异性,减少假阳性。 

  4 高自动化、方法趋于标准化、简单化,成本降低。价格高昂是目前推广应用的主要障碍之一,但随着技术的革新,基因芯片的价格将会大大降低。

  5 高稳定性。寡核苷酸探针、RNA均不稳定,易受破坏。而肽核酸(PNA)有望取代普通RNA/DNA探针,可以确保探针的高稳定性。

  6 研制新的应用芯片,如1999年美国环保局(EPA)组织专家研讨会,讨论了毒理学芯片的发展策略。近来多种新的生物芯片不断问世,这是物理学、生物学与计算机科学共同的结晶。

  7 研制芯片新检测系统和分析软件,以充分利用生物信息。

  8 芯片技术将与其它技术结合使用,如基因芯片PCR、纳米芯片等。

  9不同生物芯片间综合应用,如蛋白质芯片与基因芯片间相互作用等,可用于了解蛋白质与基因间相互作用的关系。

  当前,基因芯片数量呈几何级数在增长,功能也日益完善,但价格却大大降低。可以预见,基因芯片可能在未来3-5年,也即到2005年左右,将在医学和生物学领域中得到广泛应用,甚至普及使用!到2010年它可能成为常规的实验技术,正如个人电脑的迅速普及一样。

  基因芯片作为生物芯片的代表,其发展目标同生物芯片的目标一样是“芯片实验室”(Lab-on-chip),也即将整个生化检测分析过程缩微到芯片上。“芯片实验室”通过微细加工工艺制作的微滤器、微反应器、微泵、微阀门、微电极等以实现对生物样品从制备、生化反应到检测和分析的全过程,而且实验过程趋于自动化从而极大地缩短的检测和分析时间,节省了实验材料,而且又降低人为主观因素,大大提高实验的客观性。

  总之,基因芯片技术发展到今天不过短短几年时间,虽然还存在这样或那样的问题,但其在基因表达谱分析、基因诊断、药物筛选及序列分析等诸多领域已呈现出广阔的应用前景,随着研究的不断深入和技术的更加完善基因芯片一定会在生命科学研究领域发挥出其非凡的作用。基因芯片最终的意义和目的不再于本身,而在于它极大地提高了人类认识生命本质的能力和手段,为揭示人类这个复杂网络系统打下基础。从某种意义上我们可以这样认为:基因的结构或种类决定物种;基因的功能或表达则决定生命,即生物的生、老、病、死。基因芯片技术将为我们提供一条认识生命本质的捷径。当然基因芯片并非万能,基因的表达并非代表生命活动本质,生命执行者应是蛋白质,因而基因芯片必需同蛋白组学相关技术,如二维凝胶电泳、蛋白质芯片、大规模双杂交体系等相结合才有望真正揭示生命活动的时空过程。

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第 1 楼
* 出现 发表于 2007/5/16 10:12:51
太好了
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